质粒如何提取

推荐于2016-12-02 04:59:31 最佳答案
需要掌握技能
1. 质粒转化
具体操作步骤:
1ul 质粒DNA加入1.5ml管;
受态细菌(competent cells)-70℃冰柜快速吸取50ul受态细菌加入含质粒DNA1.5ml管;
 轻轻旋转混匀内容物放置30~60 min;
 42度热休克90s(该间应该非准确用Timer记放置5min;
 每管加500ul LB培养液放37℃水浴1h;
 吸取200ul培养物至含相应抗90mm LB平板涂布棒培养液涂布均匀;
 倒置平皿于37℃培养12~16h现菌落
2. 质粒抽提
具体操作步骤:
 用前RNase A管液体全部加 SolutionⅠ(加RNaseA溶液I般储存4℃);
60ml乙醇加洗涤缓冲液瓶
 37℃培养16h平板挑取单菌落(直径2~3mm)接种10ml LB培养液 37℃剧烈振摇培养16 h;
 取4ml菌液5ml 离8000rpm室温离3min;
放于面巾纸吸干痕液
 加250 ul Solution Ⅰ(注意用前应该加RNase A管)于涡旋振荡器重悬细胞;
 加250 ul 37℃预热2-3minSolution Ⅱ;
 加350 ul Solution Ⅲ5ml离管置于拇指食指间柔反复颠倒数
5ml离溶液倒入1.5ml 离
 室温孵育2-3min12000rpm 4℃离15 min;
 装配2ml 收集管(白色)柱状收集管(蓝色)
清倒入柱状收集管(蓝色)
 8000rpm室温离3min;
掉收集管液体加500ul Buffer HB 柱状收集管10000rpm室温离1min;
掉柱状收集管液体加750ul Wash Buffer(注意用前加乙醇)10000rpm室温离1min;
 重复述步骤
加Wash Buffer10000rpm室温离1min;
柱状管放1.5ml 离加65ul灭菌水室温放置2min8000rpm室温离3min 洗提(洗脱)DNA
3. 质粒电泳
具体操作步骤(倒20ml例):
 用50ml量筒量取20ml 1XTAE;
 用电平称量0.16g琼脂糖并倒入20ml电泳缓冲液
称量纸覆盖琼脂糖电泳缓冲液三角瓶放入微波炉转1min30s至肉眼看颗粒状琼脂止;
 至室温待溶液冷却至60度左右三角瓶溶液倒入制胶盒并加入
 至室温约30min胶凝固拔掉梳凝胶安放电泳槽内;
 向电泳槽加入电泳缓冲液凝胶约1mm;
加入适量10X缓冲液缓冲液体积计算品体积20ul加入2ul 10X缓冲液30ul加入3ul 10X缓冲液;
品加入电源120v电泳约20-30min关掉电源Dark Reader荧光透射仪观察结

其他回答

提取质粒试剂盒
风过落满地 | 发布于2011-08-03 17:22
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