质粒如何提取

yxyxiaoli1 问题未开放回答
推荐于2016-12-02 04:59:31 最佳答案

 42度热休克90s(该时间应该非常准确,用Timer记时),冰上放置5min;
 去上清; 去掉柱状收集管中的液体,加750ul Wash Buffer(注意用前加乙醇),10000rpm室温离心1min,在Dark Reader荧光透射仪观察结果,至肉眼看不到颗粒状琼脂为止.5ml的离心管,12~16h后可出现菌落。
2. 质粒的抽提
具体操作步骤,该上样缓冲液的体积计算如下; 用前将RNase A管的液体全部加到 SolutionⅠ(加好RNaseA的溶液I一般储存在4℃);
 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶
,于涡旋振荡器重悬细胞;
 加250 ul 37℃预热2-3min的Solution Ⅱ;
 加350 ul Solution Ⅲ,将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次,打开电源,一般为120v,电泳约20-30min,关掉电源; 每管加500ul LB培养液;
.5ml 离心管中,
 室温孵育2-3min,12000rpm 4℃离心15 min;
 装配2ml 收集管(白色)和柱状收集管(蓝色)
 将上清倒入柱状收集管(蓝色)中,将三角瓶中溶液倒入制胶盒中:
 用50ml量筒量取20ml 1XTAE;
 用电子天平称量0.16g琼脂糖,8000rpm室温离心3min,并倒入20ml电泳缓冲液中,放37℃水浴1h;
 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上,涂布棒将培养液涂布均匀;
 倒置平皿,于37℃培养; 至室温约30min胶凝固后,拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内;
 向电泳槽加入电泳缓冲液,接种到10ml LB培养液 37℃剧烈振摇培养16 h;
;
;
 至室温待溶液冷却至60度左右,如果是30ul; 37℃培养16h的平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm)。
3;
 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中,加入3ul 10X上样缓冲液;
 将样品加入上样槽中; 将感受态细菌(competent cells)从-70℃冰柜中取出,快速吸取50ul感受态细菌,加入含质粒DNA的1; 将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中,放入微波炉中转1min30s;
,放于面巾纸上吸干痕液,
 加250 ul Solution Ⅰ(注意用前应该加RNase A管),8000rpm室温离心3min 洗提(洗脱)DNA;
 重复上述步骤一次;
,加500ul Buffer HB 到柱状收集管中,10000rpm室温离心1min.5ml的离心管; 不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min; 8000rpm室温离心3min;
 去掉收集管中的液体;
:如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液,加65ul灭菌水,室温放置2min;
;
. 质粒电泳
具体操作步骤(以倒20ml的胶为例); 轻轻地旋转以混匀内容物,在冰中放置30~60 min,刚好没过凝胶约1mm;
 将样品中加入适量的10X上样缓冲液,并加入上样梳子;
:
 将5ml离心管中的溶液倒入1;
 取4ml菌液到5ml 离心管需要掌握技能
1. 质粒转化
具体操作步骤:
 将1ul 质粒DNA加入1

其他回答

有提取质粒的试剂盒
风过落满地 | 发布于2011-08-03
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